En este seminario se presentarán los resultados obtenidos hasta la fecha de la tesis doctoral que me encuentro realizando en el Instituto a cargo del Dr. Leonardo Acuña y la Dra. Cecilia Pérez Brandán. En estos años hemos concentrado nuestros esfuerzos en diseñar y construir antígenos vacunales novedosos que incluyan diferentes epítopes, tanto del parásito que buscamos eliminar, Trypanosoma cruzi, como bacterianos, con distintas propiedades inmunológicas.
En este trabajo, diseñamos, construimos y ensayamos en un modelo murino una proteína de fusión quimérica basándonos en dos dominios de antígenos conocidos de T. cruzi con distintos objetivos. Por un lado, utilizamos el extremo N terminal de la proteína Tc52, esencial para la sobrevida del parásito y conservada entre especies, capaz de generar una respuesta inmune humoral contra T. cruzi; y por otro lado el bien caracterizado epítope CD8+ inmunodominante, TSkb20, presente en la proteína de mayor abundancia en la superficie del parásito, TS.
En primer lugar el fragmento N-Tc52 fue amplificado por PCR del ADN de la cepa CL Brener y reamplificado para incorporar, con primers específicos diseñados con optimización de codones para E.coli, dos secuencias en tándem de TSkb20. Obtenida esta construcción génica, fue clonada en un plásmido bacteriano, el cuál fue secuenciado por electroforesis capilar. Finalmente, la proteína fue expresada, purificada y detoxificada obteniendo la quimera N-Tc52/TSkb20, cuya secuencia aminoacídica, su peso molecular y su pureza fueron caracterizadas por espectrometría de masas. En conclusión, se obtuvo una proteína pura, soluble, sin endotoxinas, del peso molecular y la secuencia aminoacídica esperada.
Seguidamente, investigamos la capacidad inmunológica de este antígeno bivalente en un esquema de inmunización/desafío en ratones. Los animales (n=10) fueron agrupados e inoculados con 3 dosis separadas por 21 días con la quimera N-Tc52/TSkb20, las proteínas recombinantes que la conforman (Tc52 y TS) y los controles junto a un adjuvante tipo saponina. A los 15 días luego de la última dosis, se tomo muestra de sangre para analizar la producción de anticuerpos y a los 21 días de la última dosis, la mitad de los animales fueron sacrificados y los bazos fueron removidos para evaluar la respuesta celular desencadenada por la vacunación. La otra mitad de los animales fueron desafiados con una dosis letal de trypomastigotes virulentos de la cepa Tulahuén. Las parasitemias fueron registradas dos veces por semana durante 25 días para evaluar la eficacia de la inmunización. En este punto, los animales fueron sacrificados y los corazones, colon y músculo esquelético fueron removidos para determinar la carga parasitaria y evaluar el daño histológico producido. Notablemente, los ratones inoculados con la proteína quimérica fueron capaces de controlar las parasitemias, reducir significativamente la carga parasitaria, la inflamación y el número de nidos de parásitos intracelulares en los tejidos evaluados.